Avaliação da influência da irradiação com laser em baixa intensidade no comportamento proliferativo e metabólico de osteoblastos humanos in vitro

Resumo

A terapia com laser em baixa intensidade tem sido utilizada para aceleração da cicatrização de feridas, porém muito dos seus mecanismos de ação não estão totalmente esclarecidos, o que reflete a divergência de resultados na literatura. A influência positiva do laser em osteoblastos seria de grande utilidade no campo da regeneração óssea. A descoberta sobre quais proteínas teriam seus perfis alterados e expressão modificada sob a ação do laser, poderia contribuir sobremaneira para o entendimento dos seus mecanismos de ação na remodelação óssea. Diante desses fatos, o objetivo do presente projeto será avaliar o comportamento de osteoblastos humanos submetidos a diferentes intensidades de fototerapia com laser. Serão plaqueadas 103 (viabilidade celular) e 5x103 (atividade enzimática e blots) células da linhagem hFOB 1.19 em placas de 96 poços, as quais serão irradiadas com laser vermelho (660nm) e infravermelho (780nm) nas doses de 3 e 5 J/cm². Os meios condicionados e osteoblastos serão coletados e avaliados quanto à viabilidade celular (contagem de células, redução do MTT e captação do Vermelho Neutro) e atividade de enzimas (fosfatase ácida total (FAT), fosfatase lisossomal (FAL) e proteína tirosina fosfatase (PTP)). A síntese de alguns transcritos e proteínas (metaloproteinases de matriz (MMPs 2 e 9), ligante do ativador do receptor do fator kappa B nuclear (RANKL) e osteoprotegerina (OPG)) será avaliada por meio de zimografia, RT-PCR e proteômica. Após a preparação das proteínas dos osteoblastos humanos, as mesmas serão submetidas à eletroforese bidimensional e zimografia. Os géis dos grupos controle e tratados serão escaneados utilizando-se o ImageScanner e analisados com o software ImageMaster Platinum. Os spots de interesse serão excisados e analisados por espectrometria de massa (MALDI-TOF) para identificação das proteínas. O RT-PCR será realizado para quantificação dos transcritos de MMP-2 e 9, RANKL e OPG. As análises estatísticas serão feitas através dos testes ANOVA, Kruskal-Wallis, e teste "t", de acordo com sua indicação (p<0,05). (AU)