Estudo do desenvolvimento e função do pistilo de Nicotiana tabacum (l.): caracterização de genes expressos no estigma/estilete e das interações proteína-proteína

Resumo

Em projeto anterior, foi identificado um gene expresso especificamente no estigma/estilete, que codifica um inibidor de CDK (SCI1 - stigma/style cell cycle inhibitor 1), responsável por controlar a proliferação/diferenciação celular, provavelmente como um componente da via de sinalização por auxina. Para realizar a sua função, a proteína SCI1 interage com ciclinas A e, provavelmente, com várias outras proteínas. Assim, os objetivos deste projeto são: 1) Estudar as interações protéicas estabelecidas por SCI1: a) Construção e "screening" de uma biblioteca de cDNAs de estigmas/estiletes (E/E) de N. tabacum, em vetor do sistema de duplo-híbrido; b) Obtenção da proteína SCI1 recombinante, produção de anticorpo policlonal, e realizar co-imunoprecipitação; c) Realizar experimentos de "pulldown" de SCI1 com proteínas de E/E; d) Realizar experimentos in vitro e/ou in planta para confirmar as interações com os possíveis candidatos identificados. 2) Estudar o papel da auxina no desenvolvimento do pistilo de N. tabacum e de Arabidopsis: a) Obtenção de plantas transgênicas expressando o gene quimérico STlG1pro::iaaM; b) Análise do fenótipo das plantas transgênicas; c) Analisar a expressão de SCI1 e de genes relacionados à auxina, em plantas selvagens e nas plantas transgênicas de N. tabacum; d) Análise dos fenótipos de plantas de Arabidopsis mutantes para o gene SCI1 e seus descendentes com plantas mutantes em genes da via das auxinas. 3) Identificar e caracterizar genes com expressão preferencial/específica no pistilo: a) Analisar a expressão por RT-PCR em tempo real nos órgãos vegetativos e reprodutivos; b) Escolher 3 genes para análises de expressão gênica mais detalhada; c) Análise da localização subcelular das proteínas, por fusão com GFP; d) Obtenção de plantas transgênicas silenciadas (RNAi) e superexpressando os 3 genes escolhidos. (AU)