Caracterização Funcional e Estrutural de Fosfolipases A2 Ácidas Tóxicas e Não-Tóxicas de Venenos de Serpentes

Resumo

Os venenos de serpentes do gênero Bothrops são ricos em fosfolipases A2 (PLA2s). As PLA2s básicas miotóxicas têm sido subdivididas em dois subgrupos: as proteínas Asp49, cataliticamente ativas usando Ca2+ como cofator; e as Lys49, inativas sobre substratos artificiais. A ausência de atividade catalítica não afeta a miotoxicidade. Por outro lado, as PLA2s ácidas presentes nos venenos de serpentes deste gênero foram pouco estudadas e pouco se sabe sobre o mecanismo de ação destas enzimas. Estas enzimas ácidas isoladas de venenos botrópicos, geralmente, não apresentam toxicidade experimental, mas, induzem importantes efeitos farmacológicos como inflamação, inibição da agregação plaquetária e hipotensão arterial. Mais recentemente, algumas enzimas ácidas demonstraram induzir efeito miotóxico e citotóxico, portanto, resolvemos investigar qual seria os possíveis resíduos de aminoácidos e/ou domínio estrutural envolvidos com estas atividades. As PLA2s ácidas de venenos de serpentes ainda não foram claramente caracterizadas do ponto de vista da relação estrutura-função, fazendo com que nos últimos anos aumentasse o interesse sobre seus estudos. O projeto propõe estudos bioquímicos, farmacológicos e estruturais comparativos entre as fosfolipases A2 ácidas tóxicas e não-tóxicas isoladas, recentemente em nosso laboratório, de venenos de serpentes na tentativa de melhor compreender o(s) possível(eis) mecanismo(s) de ação(ões) destas enzimas na miotoxicidade e citotoxicidade. Dentro deste contexto, este projeto propõe uma análise funcional e estrutural comparativa das PLA2s ácidas tóxicas e não-tóxicas isoladas dos venenos de Bothrops moojeni (BmooTX-I, PLA2 ácida tóxica e Bmoo-I-PLA2, não-tóxica), B. (n.) pauloenis (BpPLA2 ácida tóxica) e B. pirajai (BpirPLA2 ácida não-tóxica), avaliando: (i)- Isolar e caracterizar bioquimicamente estas PLA2s ácidas nativas diretamente do veneno; (ii)- Clonar e sequenciar os cDNAs das PLA2s ácidas, e expressar uma específica de B. moojeni (recPLA2); (iii)- Análise comparativa das propriedades tóxicas e farmacológicas das enzimas ácidas tóxicas e não-tóxicas nativas e recombinante; (iv)- O efeito citotóxico será avaliado sobre linhagens específicas de miotúbulos de músculo esquelético; e (v)- Estudos da relação estrutura-função serão realizados por meio de: 1-Sequenciamento completo das estruturas primárias das PLA2s; 2-Síntese química de peptídeos das regiões N- e C-terminais; 3-Modificações químicas de aminoácidos específicos, e 4-Tentativa de elucidação da estrutura tridimensional destas diferentes proteínas por técnicas de cristalografia de raios X e modelagem molecular. Desta forma, este projeto permitirá a possível tentativa de melhor compreensão do mecanismo de ação das PLA2s ácidas sobre a toxicidade, podendo colaborar para a geração de ferramentas para a pesquisa básica e aplicada. (AU)