Substituição do equipamento multiusuário de espectrometria de massa LC/MS/MS: oxigênio singlete e hidroperóxidos em sistemas químicos e biológicos

Resumo

O presente projeto visa a substituição do equipamento de espectrometria de massa-Quatro II ("Triplo-Quadrupolo") doado há dez anos pela FAPESP para grupo multiusuário do Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da USP. O equipamento é essencial para diversos grupos de pesquisa que utilizam a técnica rotineiramente (vide lista anexa), além de outros grupos de diversas Universidades paulistas e brasileiras que fazem experimentos ocasionalmente. O equipamento operou de forma contínua , inclusive fins de semana, nestes últimos dez anos. Entretanto, a sua tecnologia já está defasada o que levou a interrupção da produção de equipamentos e peças de reposição dessa geração. O grupo responsável já foi alertado pelos técnicos da empresa que na próxima manutenção, provavelmente a máquina não terá condições de reparo.Considerando a necessidade da técnica para continuarmos realizando pesquisa internacionalmente competitiva, a intensa utilização por grupos de outras áreas e a qualidade da produção do grupo multiusuário, solicitamos a sustituição do equipamento por outro com tecnologia moderna.Esse pedido está sustentado cientificamente pelo projeto temático (Proc. 06/59458-2) em análise. O resumo deste projeto está em documento anexo. Os nossos estudos estão centralizados em desvendar os mecanismos pelos quais espécies reativas de oxigênio, principalmente o oxigênio singlete, desempenham papéis fisiológicos e patológicos. Os estudos sobre a peroxidação de lipídios têm aumentado nos últimos anos devido a descobertas sobre o papel dos hidroperóxidos lipídicos (LOOH) em câncer de pele induzido por UV, aterosclerose, doenças neurodegenerativas e diversas outras patologias. Os LOOH são compostos potencialmente deletérios capazes de promover danos em biomoléculas, incluindo proteínas e DNA. Por terem, geralmente, vida média mais longa que os radicais livres precursores, tornam possíveis translocações na célula, entre células, ou entre lipoproteínas e células. Desta forma, a toxicidade dos LOOH e suas ações como efetores podem se manifestar em locais da célula mais distantes do seu sítio de formação. Um outro aspecto importante da ação biológica dos LOOH, que está apenas começando a ser desvendado, está relacionado com o papel dos LOOH na transdução de sinal. Estudos recentes sugerem que LOOH estão envolvidos nos eventos iniciais responsáveis pela liberação do citocromo c da mitocôndria e indução da apoptose. Tal sinalização pode determinar se uma célula vai sobreviver, ou não, frente a um insulto oxidativo. Grande parte dos efeitos citotóxicos e genotóxicos de LOOH tem sido atribuída a fomação de radicais livres e de produtos secundários e terciários resultantes de sua decomposição. Técnicas de detecção por HPLC acopladas a espectrometria de massa em tandem HPLC-MS/MS), mostraram claramente que LOOH podem interagir com metais e outros oxidantes, como peroxinitrito, gerando oxigênio singlete 1O2), espécie altamente reativa envolvida em diversos processos celulares. Este estudo tem por objetivo investigar a formação de oxigênio singlete via hidroperóxidos de lipídios, proteínas e DNA em sistemas biológicos. Reações de oxigênio singlete com biomoléculas e os mecanismos biológicos associados à formação desta espécie também serão investigados. A formação e a caracterização das reações envolvidas nos mecanismos citotóxicos e genotóxicos mediados pelos ROOH (LOOH e outros hidroperóxidos não lipídicos) em sistemas biológicos também são objetivos deste projeto. Com este intuito serão desenvolvidas metodologias para a detecção e quantificação de diferentes classes de ROOH, baseadas em HPLC-MS/MS utilizando compostos marcados isotopicamente como padrões internos. Também serão caracterizados danos em proteínas, em particular no citocromo c, e em DNA mitocondrial resultantes da interação com ROOH. (AU)