Avaliacao dos efeitos induzidos por cumarians sobre a atividade inflamatoria e biologica de pla2 de serpentes bothrops jararacussu e crotalus durissus collilineatus.

Resumo

Este projeto tem como objetivo avaliar o efeito da incubação de PLA2 cataliticamente ativas de Crotalus durissus collilineatus com diferentes cumarinas sintéticas sobre a estrutura e atividade farmacológicas induzidas por esta enzima na ausência destes compostos. Também serão avaliados os efeitos da cumarina com PLA2 cataliticamente não ativas de Bothrops jararacussu. Para realização deste projeto será isolada a PLA2 de Crotalus durissus collilineatus e Bothrops jararacussu com alto grau de homogeneidade molecular, garantida pela utilização de HPLC de fase reversa, eletroforese em PAGE-SDS Tricina e espectrometria de massa. As PLA2 isoladas serão previamente incubadas com cumarinas sintéticas, durante um tempo a ser padronizado a fim de se obter o melhor resultado. Para uma avaliação mais precisa das alterações induzidas pelas cumarinas sobre a PLA2, pretendemos separa-la através de HPLC de fase reversa. Uma vez isolada a molécula, ela será examinada por técnica de dicroísmo circular a fim de verificar as alterações moleculares em nível de estrutura secundária, correlacionando com alterações da estrutura terciária em solução, pelas técnicas de SAXs e possíveis modificações na estrutura primária das PLA2 modificadas. Decorrido essa fase, pretende-se utilizar as PLA2 isoladas do tratamento com cumarinas em ensaios enzimáticos e em ensaios farmacológicos a fim de verificar qual efeito real do tratamento da cumarina com a molécula de PLA2, para isso, serão empregados os seguintes ensaios: - Atividade enzimática: serão analisados os efeitos das cumarinas sobre os parâmetros enzimáticos das PLA2 ativas. - Neurotoxicidade em junção neuromuscular de camundongos e pintainhos - Miotoxicidade em músculo gastrocnêmico de rato: como a miotoxicidade é um dos principais eventos patológicos do envenenamento por venenos de serpentes, será avaliado o potencial antimiotóxico das cumarinas sobre as PLA2. - Inflamação: a atividade inflamatória será realizada usando-se o edema de pata como modelo de estudo, utilizando PLA2 previamente tratadas com cumarinas. - Agregação plaquetária: Para estes ensaios avaliaremos o efeito de PLA2 nativas ou modificadas sobre dois modelos de agregação plaquetária, uma em plasma rico em plaqueta ou modelos de plaquetas lavadas. - Secreção de insulina: A secreção de insulina pode ser potencializada por algumas toxinas de serpentes, por diferentes mecanismos. O efeito do tratamento de PLA2 com cumarinas pode ser sensivelmente analisado na secreção de insulina. (AU)