Caracterizacao de genes preferencialmente expressos no estigma/ estilete de nicotiana tabacum, identificados por macroarray e ssh.

Resumo

As flores são essenciais para a reprodução sexual das angiospermas, que representam a grande diversidade das plantas terrestres. A reprodução sexual se inicia com a polinização. Após interações homólogas e compatíveis entre o grão de pólen e o pistilo, há a fertilização. O pistilo apresenta uma dupla função: produzir os gametófitos femininos (nos ovários) e discriminar entre os diferentes grãos de pólen recebidos (papel exercido pelos tecidos especializados do estigma e estilete). Portanto, em última análise, o estigma e o estilete têm um papel decisivo na determinação do genótipo dos futuros embriões e plantas. Entretanto, apesar da importância destes órgãos no sucesso dos processos de polinização e fertilização, ainda são poucos os genes de estigma/estilete caracterizados até o momento, principalmente em plantas de estigmas úmidos. Com o objetivo de estabelecer uma visão integrada do desenvolvimento do estigma/estilete e suas funções na interação pólen-pistilo, uma análise em larga escala da expressão gênica nestes órgãos está em andamento em nosso laboratório. A espécie Nicotiana tabacum está sendo usada como modelo de estudo de plantas com estigma úmido, por conter flores grandes, com todos os órgãos florais facilmente identificáveis. Os objetivos deste projeto são: 1) Escolher 10 genes com expressão preferencial em estigmas/estiletes (já definidos pela técnica de "macroarray") e fazer o seqüenciamento completo de um clone de cDNA representativo de cada gene; 2) Analisar a expressão destes genes em raízes, caules, folhas, sépalas, pétalas, estames, estigmas/estiletes e ovários pela técnica de RT-PCR em tempo real; 3) Analisar a expressão destes genes, em estigmas/estiletes em diferentes estágios do desenvolvimento floral por RT-PCR em tempo real; 4) Analisar a expressão dos transportadores ABC, da subfamília WBC, identificados no processo FAPESP 00/04603-1, por RT-PCR quantitativo; 5) Identificar novos genes específicos de estigmas/estiletes de N. tabacum, construindo e seqüenciando uma biblioteca subtrativa (SSH), obtida de cDNA de estigmas/estiletes como "tester" e cDNA. de órgãos vegetativos como "driver"; 6) Confirmar a expressão específica de pelo menos 5 genes identificados por SSH, através da técnica de RT-PCR em tempo real. 7) Escolher pelo menos 2 genes, de expressão preferencial nos estigmas/estiletes, para localização do mRNA por hibridização in situ. 8) Estudar o papel das pectinases no processo reprodutivo, através da superexpressão e do silenciamento do gene NtPAE1 (004A06), específico do pistilo (como determinado por macroarray e RT-PCR em tempo real), em plantas transgênicas. Espera-se, ao final deste trabalho, ter identificado e caracterizado pelo menos 15 novos genes, de expressão preferencial nos estigmas/estiletes, que servirão de base para estudos mais aprofundados sobre o funcionamento destes órgãos. (AU)