Caracterizacao funcional de proteinas envolvidas no controle da expressao genica.

Resumo

Este projeto tem como meta explorar a interface entre os componentes da maquinaria de tradução e processamento de RNA visando estabelecer os mecanismos de controle da expressão gênica. O estudo destes mecanismos é essencial para se entender situações críticas por que a célula passa como, por exemplo, invasão celular por vírus e repostas a agentes de controle do crescimento, proliferação ou de indução à apoptose. A abordagem experimental envolve a caracterização funcional e estrutural, bem como o mapeamento das interações proteína-proteína e proteína-RNA, de fatores envolvidos na síntese da maquinaria de tradução, na maturação e tradução de RNAs específicos e nas vias de sinalização que controlam a expressão gênica. A proteína Nip7 está envolvida com o processamento de precursores de rRNA ribossomal, no entanto sua função molecular ainda não foi decifrada. Identificamos a interação entre Nip7 e a proteína SBDS, codificada pelo gene associado à Síndrome de Shwachman-Bodian-Diamond (SBDS). A principal hipótese neste caso é estabelecer se há uma relação entre defeitos no processamento de rRNA e síndrome de Shwachman-Bodian-Diamond. O processo de síntese de proteínas é regulado de várias formas sendo que a regulação envolve desde a estrutura do mRNA até modificações pós-traducionais dos fatores de tradução em resposta a sinais fisiológicos e ambientais. Dentre as proteínas em estudo no laboratório temos a ISG95 que é uma proteína humana cuja transcrição do seu mRNA é ativada por infecção pelos vírus da hepatite C (HCV) e vírus Vaccínia. A ativação da transcrição do mRNA da ISG95 também ocorre em resposta a tratamento com os interferons alfa e gama sendo que as vias dos interferons são sabidamente ativadas em resposta à infecção viral. ISG95 possui domínios conservados, encontrados em proteínas formadoras de cap de mRNA e os objetivos do seu estudo é determinar se possui atividade bioquímica de formação de cap e se a ativação de sua expressão tem efeito de proteção celular em relação infecção viral. A maioria dos vírus codifica em seu genoma as proteínas necessárias para sua replicação, mas dependem completamente da maquinaria celular para a síntese de suas proteínas. Os Flavivírus são mRNA de fita positiva diferindo dos mRNAs celulares por possuírem estruturas secundárias estáveis na sua região 3’ não traduzida em vez de uma cauda de poli-adenina. Existe a hipótese de que estas estruturas secundárias desempenham papel análogo à cauda de poli-adenina. Identificamos em nosso laboratório a interação da proteína humana PACT com a região 3’SL do vírus da Dengue. PACT é ativadora da quinase de proteína PKR, a qual fosforila o fator de tradução eIF2alfa levando a uma redução geral da síntese de proteínas. PKR, além de responder a tratamento com interferon, como a ISG95, está na via de reposta celular a infecção viral. As hipóteses a serem testadas no caso da interação PACT-RNA do vírus da dengue são determinar se a interação é específica e se PACT está na via de resposta celular a infecção pelo vírus da Dengue. Além e responder à infecção viral, a síntese de proteínas é regulada por vários agentes como o imunossupressor rapamicina, a qual também possui a capacidade de bloquear a proliferação celular, sendo que aproximadamente 25% dos tumores respondem ao tratamento com rapamicina. O alvo final da rapamicina na maquinaria de tradução é o fator eIF4E que é regulado pela eIF4E-BP. Em estudos prévios caracterizamos uma proteína desta via denominada alpha4, a qual interage com a subunidade catalítica das fosfatases do tipo 2A. Uma segunda proteína que interage com estas fosfatases é a hTIP41. Através do sistem duplo-híbrido de levedura identificamos a interação da hTip41 com as subunidades catalíticas das fosfatases PP2Aalfa, PP2Abeta, PP4 e PP6, além dos fatores de transcrição MafB e TAF10. Os experimentos neste caso envolvem determinar o mecanismo de regulação da destas fosfatases e destes fatores de transcrição pela proteína e hTip41. (AU)