Estudo integrado do equilíbrio hidrossalino: aspectos fisiológicos e moleculares da regulação neuroendócrina e avaliação de aspectos clínicos e experimentais

Resumo

A complexidade dos mecanismos de controle da homeostase hidroeletrolítica tem impulsionado a realização de investigações das vias aferentes, das vias integrativas e das vias eferentes envolvidas neste paradigma fisiológico, permanecendo ainda algumas questões a serem esclarecidas. Nos mamíferos, a regulação do volume e da osmolalidade plasmática envolvem a participação de osmoreceptores/sódio receptores, bem como de volume ou presso-receptores que recebem informações das alterações da homeostase hidrosssalina, as quais são integradas em áreas específicas do SNC. Entre estas, destacam-se a região AV3V (OVLT e MnPO), órgão subfornicial (SFO), núcleos paraventricular (PVN) e supraóptico (SON), locus ceruleus, núcleo dorsal da rafe e núcleo parabraquial lateral. Estas estruturas estão envolvidas na indução de sede e na ingestão de sal, nas alterações da atividade simpática, na ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), secreção de vasopressina {A VP) e ocitocina (OT) pela hipófise posterior, e peptídeo atrial natriurético (ANP) pelo coração. O ANP está localizado principalmente no coração, porém, a sua presença e a de seu receptor também foram descritas em áreas do SNC envolvidas com o controle do volume circulante e da pressão sanguínea, como o hipotálamo e o tronco cerebral. Vários estudos têm demonstrado que a expansão de volume induz também a liberação de ANP cerebral, por meio de impulsos aferentes dos baroreceptores para o cérebro. Há uma interação do sistema ANPérgico e os hormônios neurohipofisários, principalmente a OT, como evidenciado pela redução do ANP plasmático em resposta à expansão de volume em animais com lesão de eminência mediana ou neurohipofisectomia. Portanto, as investigações conduzidas até o momento no nosso laboratório apontam para uma integração regulatória entre vias secretórias de OT, AVP e ANP na manutenção do balanço de sal e água. O óxido nítrico (NO) tem sido proposto como um modulador local da atividade dos neurônios magnocelulares. Além do NO outros moduladores, como os agonistas colinérgicos, adrenérgicos, sistema serotoninérgico e peptidérgicos, podem estar envolvidos nos mecanismos de liberação dos vários peptídeos moduladores da regulação do balanço hidroeletrolítico. Portanto, um dos objetivos deste temático, contemplado no subprojeto 1, é estudar os mecanismos envolvidos na liberação de OT, AVP, e ANP no sistema nervoso central e em órgãos periféricos envolvidos na regulação do balanço hidro-eletrolítico, bem como a participação do óxido nítrico e de outros fatores na modulação destes mecanismos. Assim, o Projeto .1 "Controle neuroendócrino do equilíbrio hidrossalino" estará subdividido em vários sub-projetos: Sub-projeto 1.1: "Controle neuroendócrino do equilíbrio hidro-eletrolítico: participação da serotonina e ocitocina" Sub-projeto 1.2: Expressão da proteína c-fos e/ou da ocitocina em estruturas do SNC e avaliação da concentração plasmática de ANP, AVP e OT, após estimulação osmótica, angiotensinérgica e colinérgica. Sub-projeto 1.3: Participação do óxido nítrico no controle da secreção de vasopressina e ocitocina. Sub-projeto 1.4: Estudo da participação e caracterização de vias angiotensinérgicas e serotoninérgicas centrais no apetite por sódio em ratos. Sub-projeto 1.5: Participação do núcleo parabraquial lateral e vias serotonérgicas centrais na modulação das respostas neuroendócrinas envolvidas no controle do volume e osmolalidade dos líquidos orgânicos. Sub-projeto 1.6: Efeito da variação da osmolalidade sobre a liberação do peptídeo natriurético atrial (ANP) pelo hipotálamo basal incubado in vitro: modulação nitrérgica. Sub-projeto 1.7: Ações de fatores de regulação da liberação de ANP em cultura primária de cardiomiócitos atriais. Em situações de estresse, o organismo promove a ativação de alguns sistemas de controle como o sistema nervoso autônomo, sistemas neuroendócrinos (eixo HHA), sistema cardiovascular e sistema imunológico. No modelo de estresse induzido pela administração de LPS muitos hormônios sofrem variações em suas concentrações plasmáticas (exemplos: CRH, ACTH, PRL, AVP e OT). Nestas respostas o NO e o CO parecem participar na modulação da liberação de AVP, OT e PRL. Desta forma, no Projeto 2 "Regulação da liberação de ocitocina, vasopressina e prolactina durante o choque séptico experimental" avaliaremos a participação do NO e CO como mediadores da regulação da secreção de OT, AVP e PRL durante o estresse induzido por LPS. Além da presença nos neurônios magnocelulares, a AVP está também presente nos neurônios parvo celulares do PVN, onde está co-localizada com o hormônio liberador da corticotrofina (CRH). A ação sinérgica entre a AVP parvo celular e o CRH no controle da atividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA), principalmente em resposta a estímulos de estresse e adrenalectomia, está bem definida. Por outro lado, o papel exercido pela AVP magnocelular na regulação da secreção do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) ainda é controverso. Os principais procedimentos experimentais que avaliam os mecanismos moleculares envolvidos na regulação do eixo HHA, em situações de insuficiência adrenal induzida pela ADX, sob estresse e sua interação com o padrão alimentar estão contemplados no Projeto 3 "Regulação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA)" que se subdivide nos seguintes sub-projetos: Sub-projeto 3.1: Regulação da expressão dos receptores do hormônio liberador da corticotrofina (CRH-r1, CRH -R2a e CRH -R2ß) e da vasopressina (V1b) após diferentes períodos de adrenalectomia (ADX): efeitos do estresse. Sub-projeto 3.2: Interação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal com o sistema da melanocortina central. Modelos clínicos de deficiência de vasopressina (diabetes insípido central) na sua forma congênita ou adquirida também nos permitem estudar as interações entre a AVP e o eixo HHA. A forma congênita de diabetes insípido central no homem é bastante rara. Em um dos subprojetos deste temático, caracterizaremos as alterações moleculares de uma família com diabetes insípido central familiar. Utilizaremos, ainda, um modelo experimental de compressão de haste hipofisária que fornece um paralelo com o diabetes insípido central clínico adquirido. Portanto, no subprojeto 4 "Diabetes Insípido Central", além do estudo molecular do gene A VP-NPII, em pacientes com Diabetes Insípido Central, estudaremos também em modelo experimental a expressão gênica da A VP e do CRH no hipotalálamo e suas interações em resposta ao estímulo osmótico agudo e crônico. Outro componente que desempenha um papel fundamental na regulação do volume extracelular e na homeostase de sódio é o sistema renina/angiotensina IV aldosterona (SRAA). A homeostase hidrossalina depende da interação de mecanismos que diminuem a excreção de sódio e água como a atividade do SRAA, vasopressina, sistema nervoso autônomo e de mecanismos que aumentam esta excreção como atividade do ANP e óxido nítrico. Assim, no projeto 5 "A Hiperplasia Adrenal Congênita (HAC) e as alterações do equilíbrio hidrossalino" temos como objetivo o estudo da interação desses sistemas, tanto em modelos animais como em modelos humanos, em que há interrupção da atividade do SRAA pela deficiência da secreção de aldosterona. Para tanto, utilizaremos a adrenalectomia como modelo experimental para estudo da expressão e localização dos mRNAs dos diferentes subtipos de receptores de CRH na hipófise, no NPV e em tecidos periféricos, e do receptor VI b da vasopressina na hipófise. Ainda, em humanos, estudaremos aspectos moleculares e funcionais nas duas formas mais frequentes de HAC. Avaliaremos o papel do ANP, antagonista do SRAA, e sua interação com a atividade de renina plasmática (ARP) na hiperplasia adrenal congênita por deficiência de 21-hidroxilase (D210H). Um outro objetivo deste projeto será delinear o perfil do complexo gênico 21-0H em famílias da região nordeste do Estado de São Paulo, com pelo menos um membro portador de HAC por deficiência da 21-0H, determinando as frequências de haplótipos com deleções, conversões, duplicações gênicas e de mutações de ponto, no gene CYP21. Finalmente, buscar-se-á uma correlação entre genótipo, fenótipo e perfil hormonal dos indivíduos afetados. Adicionalmente, o nosso grupo de pesquisa tem estudado pacientes com HAC por deficiência de 11-ßOH e demonstramos uma alta prevalência da mutação Q356X no gene CYP11B1, em pacientes brasileiros de origem africana. Um outro objetivo deste projeto será a caracterização de indivíduos heterozigotos para a mutação Q356X e a correlação com estudo hormonal funcional. Portanto, o projeto 5 divide-se em: Sub-projeto 5.1: Hiperplasia adrenal congênita por deficiência da 21-hidroxilase Sub-projeto 5.2: Estudo molecular da deficiência da 21-hidroxilase. Correlação genótipo e fenótipo. Sub-projeto 5.3: Estudo molecular do gene CYP11B1 e avaliação funcional em indivíduos heterozigotos para a deficiência da 11 beta hidroxilase. Para o desenvolvimento deste projeto utilizaremos técnicas já amplamente desenvolvidas em outros projetos experimentais, como estereotaxia, implantação de cânulas intracerebroventricular, implantação de "minipumps", neurohipofisectomia, adrenalectomia, assim como avaliações funcionais do eixo HHA e da homeostase hidroeletrolítica já amplamente utilizada em investigação clínica e animal. Utilizaremos, ainda, técnicas de biologia molecular já implantadas, como o preparo das diferentes sondas e dos tecidos para a realização da hibridização in situ, ensaio de proteção a ribonuclease, Western blot, imunocitoquímica, PCR e sequenciamento automático de genes. Contamos, ainda, com uma equipe de pesquisadores com alto grau de interação, que utiliza tanto modelos experimentais como de investigação clínica, o que tem permitido publicações científicas com uma visão mais integrada da neuroendocrinologia. (AU)