Explorando a Via SLIT-ROBO na Patogênese da Retinopatia Falciforme: Estudos In Vitro com Células de Retina ARPE-19 e Soro de Pacientes

Resumo

O termo doença falciforme (DF) é utilizado para caracterizar um grupo de hemoglobinopatias que têm em comum uma mutação pontual no sétimo códon do gene da beta-globina, localizado no cromossomo 11p15.5.7. As complicações oftalmológicas são frequentes nas doenças falciformes e incluem anormalidades na conjuntiva, infartos orbitários, retinopatia e hemorragia retiniana. As alterações retinianas são as mais importantes para a morbidade ocular nas doenças falciformes, especialmente sua forma proliferativa, que se configura como maior causa de perda progressiva da visão nesses pacientes, levando ao comprometimento visual em 10 a 20% dos olhos afetados. A estimativa da prevalência da retinopatia falciforme (RF) proliferativa é de 32,8% em heterozigotos compostos HbSC, 14% na S-beta talassemia e 2,6% na anemia falciforme (homozigotos HbSS).A fisiopatologia da RF conta com a agregação de hemácias falcizadas, ativação do endotélio e de cascatas tromboinflamatórias, que culminam na oclusão arteriolar da retina periférica. Na RF proliferativa a isquemia resultante estimula a neovascularização com a formação de vasos frágeis, que podem levar à hemorragia vítrea e descolamento retiniano, com perda de visão. A causa precisa da formação de neovasos nas doenças falciformes não está totalmente esclarecida, de tal modo que a retinopatia nestes indivíduos oferece um instigante modelo de estudo, dada sua ligação com um genótipo sistemicamente mais brando, BSBC, e a propriedade comum de regredir espontaneamente.A via SLIT-ROBO tem sido estudada por desempenhar um papel importante na vasculogênese e angiogênese, incluindo a angiogênese ocular. Um estudo prévio do nosso grupo de pesquisa contou com a utilização do RNA-Seq para avaliação do perfil de expressão gênica de células endoteliais formadoras de colônias (CEFCs) de indivíduos SS e SC com e sem retinopatia proliferativa (processo FAPESP 2015/14255-6). Como resultado, foram encontrados genes diferencialmente expressos envolvidos em vias de proliferação celular, angiogênese e inflamação, destacando a alteração na expressão gênica do gene Roundabout guidance receptor 1 (ROBO1). Estudos descrevem a participação do ROBO1 na angiogênese induzida por VEGF-A, indicando sua importância em processos angiogênicos. O gene ROBO1 está expresso nos vasos da retina e desempenha um papel fundamental na neovascularização retiniana, particularmente durante a formação do plexo vascular superficial e profundo. Além disso, o SLIT2 tem sido extensivamente estudado na participação da vasculogênese. Embora alguns estudos descrevam a via SLIT-ROBO, o seu papel na retinopatia falciforme ainda não foi demonstrado.Devido às limitações em obter amostras de retina humana para estudos experimentais, o objetivo principal deste projeto é conduzir ensaios in vitro para avaliar o papel da via de sinalização SLIT-ROBO na retinopatia falciforme. Além disso, busca-se identificar alvos a jusante dessa via que possam estar associados ao desenvolvimento da retinopatia falciforme, contribuindo para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da RF. Neste estudo, iremos utilizar o sangue periférico de pacientes HbAA, HbSS e HbSC com e sem retinopatia falciforme para suplementação da linhagem ARPE-19, uma linhagem celular de epitélio pigmentar da retina. Após o tratamento, as células ARPE-19, com e sem suplementação, serão submetidas aos protocolos experimentais: extração de RNA e proteínas, ensaio de proliferação/viabilidade celular, ensaio de invasão e migração e ensaios de apoptose, lém da análise de qRT-PCR e western blot. Com isso, acreditamos que os resultados obtidos no presente projeto poderão contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na retinopatia falciforme e servir como base para subsequentes estudos. (AU)