Mecanismos genéticos e fisiopatológicos em distúrbios mendelianos do neurodesenvolvimento: investigação dos genes AHDC1 e EHMT2

Resumo

Transtorno de neurodesenvolvimento é um termo que abrange condições nas quais há alterações no desenvolvimento cerebral, como deficiência intelectual (DI) e transtorno do espectro autista (TEA), entre outros. Este estudo se propõe a investigar mecanismos genéticos e fisiopatológicos relacionados a alterações em dois genes principais para DI/TEA: AHDC1, reconhecidamente causa de uma forma sindrômica autossômica dominante (síndrome de Xia-Gibbs - SXG) e EHMT2, gene evidenciado por nosso trabalho como candidato a DI sindrômica autossômica recessiva. A proposta é o desenvolvimento de modelos celulares para estudo funcionais, visando principalmente a avaliação de hipótese de EHMT2 como gene causal, assim como a elucidação de mecanismos moleculares que desencadeiam os fenótipos dos pacientes com mutações em ambos os genes (AHDC1 e EHMT2). Um projeto prévio de nosso grupo (FAPESP 2018/08486-3;2013/08028-1) estabeleceu linhagens iPSC (induced pluripotent stem cells) de três pacientes com SXG; no mesmo projeto, foi identificada uma variante em homozigose afetando sítio de splicing canônico de EHMT2 em paciente com DI sindrômica. Mais recentemente, nove casos adicionais de SXG foram recrutados. As etapas deste projeto são: (1) caracterização clínica detalhada de casuística brasileira de 13 pacientes com SXG, com o intuito de ampliar o espectro clínico e estabelecer relações genótipo-fenótipo, visto a expressividade variável da condição; (2) ampliação do número de linhagens celulares de SXG para estudo funcional, a partir da coleta de PBMC (peripheral blood mononuclear cells) de sete pacientes adicionais, com reprogramação em iPSC (totalizando dez linhagens); (3) banco de DNA de sangue periférico de pacientes com SXG para fins de caracterização de alterações epigenéticas e desenvolvimento de uma assinatura epigenética específica; (4) investigação da hipótese de EHMT2 como gene candidato a uma nova síndrome de transtorno de neurodesenvolvimento por análise de episignature de DNA de sangue periférico; (5) coleta de PBMC e reprogramação em iPSC da paciente com variante em homozigose em sítio de splicing no gene candidato EHTM2; (6) obtenção por CRISPR-Cas9 de três linhagens com mutações bialélicas em EHTM2; (7) estabelecimento de três linhagens iPSC controles (totalizando seis) a partir de PBMC de indivíduos neurotípicos; (8) diferenciação das linhagens iPSC com mutações em ADHC1 e EHTM2, além das controles, em neurônios corticais; (9) utilização de células-tronco neurais (NSC) e neurônios corticais maduros (60 dias de diferenciação) para estudo de transcriptoma (RNAseq) e (10) morfologia celular; (11) estudo de localização subcelular da proteína AHDC1 por imunofluorescência. (12) estudo de eletrofisiologia em neurônios da SXG para avaliar neste modelo celular se há relação com a posição de variantes em AHDC1 de pacientes com ou sem epilepsia.; Contribuições esperadas: (1) elucidação de aspectos moleculares da SXG e de mutações bialélicas em EHMT2; (2) gerar dados que contribuam para o entendimento do epigenoma de pacientes com mutações em AHDC1, com potencial desenvolvimento de assinatura epigenética; (3) avaliação da hipótese de que EHMT2 é gene causal em uma nova síndrome autossômica recessiva de transtorno de neurodesenvolvimento. (AU)