Do desenvolvimento de modelos pulmonares humanos tridimensionais de infecção à evolução de modelos pulmonares humanos funcionais para o estudo da interação com biofilme de Histoplasma capsulatum

Resumo

Histoplasma capsulatum var capsulatum é o fungo dimórfico causador da histoplasmose, infecção pulmonar que pode se disseminar para outros órgãos, ocasionando formas graves da doença. A histoplasmose é a quarta micose que mais atinge pessoas anualmente e está mundialmente distribuída, sendo considerada uma Infecção Fúngica Invasiva (IFI) classificada como de alta relevância mundial pela OMS em 2022. Por se tratar de um patógeno intracelular, diversos genes da célula hospedeira tem sua expressão induzida pelo fungo para tornar o macrófago mais suscetível à sobrevivência e proliferação que podem ser diretamente relacionadas aos fatores de virulência do patógeno. Acreditamos que a interação patógeno-hospedeiro de biofilmes de H. capsulatum desencadeia a ativação de diferentes genes que fazem com que os macrófagos sejam mais susceptíveis à infecção por biofilmes se comparada à infecção por células planctônicas, sendo que os biofilmes de H. capsulatum são mecanismos de infecção que desencadeiam diversos fatores de virulência. Além da ligação das comunidades ao substrato, acreditamos que as interações célula-célula que caracterizam um biofilme, afetam a agressividade da infecção. Dessa maneira, este projeto de pesquisa tem como objetivos desenvolver e caracterizar modelos de cultivos celulares tridimensionais mais fidedignos ao que acontece in vivo de esferóides mono e co-cultivo de pulmão humano utilizando as células MRC-5 e THP-1 macrófago-like, e modelo de tecido pulmonar humano funcional utilizando as células hSAEC diferenciadas por Air-Liquid Interface (ALI), MRC-5 e THP-1 macrófago-like através de técnicas de microscopia confocal de varredura a laser (MCLV), microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e RT-PCR para avaliação da interação biofilme-hospedeiro de H. capsulatum; caracterizar a infecção ao vivo por biofilmes de H. capsulatum com adesinas bloqueadas por anticorpos monoclonais (Hsp60, 14-3-3, enolase, GAPDH e Dectina-1) nos modelos tridimensionais através de sistema microfluídico Cell ASIC Onix (MilliPore), caracterizando o processo infectivo por RT-qPCR dos genes Hsp60, CatB, DDR48, GAPDH e CBP1 referentes ao fungo e que estão diferencialmente expressos em biofilmes, e os genes das células hospedeiras C3ar1, Gnb2 e Pdcl (da via se sinalização GPCR), Ithb2 e Fermt3 (da via alternativa da ativação da integrina), e Actb,Nckap1l (do citoesqueleto de actina), e microscopia confocal; determinar os mecanismos de interação patógeno-hospedeiro importantes na infecção por biofilmes de H. capsulatum através do screening do genoma total por CRISPR/Cas9 de células THP-1 CRISPRKO transformadas e inseridas nos modelos tridimensionais; e por fim, avaliar a influência dos genes das células hospedeiras importantes na sobrevivência de biofilmes de H. capsulatum após o tratamento com derivados de nitrofuranos utilizando o screening do genoma total por CRISPR/Cas9 nos modelos produzidos com THP-1 CRISPRKO transformadas. (AU)