Efeito pró-osteogênico das fitocistatinas CsinCPI-2 e CaneCPI-5 no reparo ósseo: estudo in vitro e in vivo

Resumo

O objetivo do presente estudo será avaliar o efeito pró-osteogênico das fitocistatinas CsinCPI-2 e CaneCPI-5, por meio de estudos in vitro e in vivo. Especificamente, o estudo in vitro avaliará o efeito modulador das fitocistatinas na resposta de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos (BMDMs) e na diferenciação osteoblástica de células primárias mesenquimais indiferenciadas de medula óssea de camundongos (BMSCs). A modulação dos macrófagos será avaliada por análises da expressão gênica (RT-qPCR) e produção/secreção proteica (Western blot/ensaio CBA) de citocinas (pró- ou anti-inflamatórias) e outras moléculas alvos que caracterizem um perfil fenotípico dentro do espectro compreendido entre as polarizações para M1 ou M2. Para avaliação da diferenciação osteoblástica, serão analisadas a expressão gênica e produção proteica de marcadores ósseos, além da atividade de fosfatase alcalina e formação de nódulos de mineralização pelo método vermelho de alizarina. Ainda no estudo in vitro, BMDM e BMSC serão cultivadas em co-cultura sob scaffolds de poli-µ- caprolactona (PCL) com incorporação das fitocistatinas. Neste experimento será avaliado a diferenciação osteoblástica sob estímulo direto ou indireto das fitocistatinas. O estudo in vivo será conduzido após a obtenção dos resultados in vitro e deverá avaliar a reparação óssea de defeitos críticos induzidos na calvária de camundongos tratados com scaffolds 3D de PCL com incorporação da fitocistatina que melhor apresentar resposta in vitro favorável à reparação óssea. Também será empregada a técnica de terapia celular com BMSCs associadas ao scaffold e à cistatina previamente selecionada. Serão utilizados 84 camundongos BALB/C, divididos aleatoriamente em 07 grupos experimentais: Grupo controle negativo/Coágulo (defeito de calvária sem tratamento), Grupo veículo (defeito de calvária + scaffold + gel veículo), Grupo controle positivo (defeito de calvária + scaffold + BMP2), Grupo Tratamento 1 (defeito de calvária + scaffold + fitocistatina selecionada), Grupo Tratamento 2 (mesmo que o grupo tratamento 1 associado à terapia celular com BMSCs), Grupo Tratamento 3 (mesmo que o grupo veículo, associado à terapia celular com BMSCs) e Grupo Tratamento 4 (mesmo que grupo veículo associado à terapia celular com células BMSCs previamente tratadas com a fitocistatina de escolha). Os animais serão eutanasiados em 2 períodos pós-tratamento: 05 dias (n=6/grupo) e 42 dias (n=6/grupo). O tecido coletado nos defeitos após 05 dias de reparação serão analisados por multiplex (análise proteica) e por histologia/imuno-histoquímica, para avaliar diferentes proteínas relacionadas à formação óssea e à diferenciação/atividade de osteoblastos. Os blocos ósseos com os defeitos removidos nos períodos de 42 dias serão analisados por microtomografia computadorizada e histologia para avaliação da formação óssea nas áreas dos defeitos. Além disso, análise imuno-histoquímica será realizada para identificar e localizar proteínas relacionadas com diferenciação osteoblástica e formação óssea. Serão utilizados testes estatísticos apropriados para comparações entre os grupos e adotado nível de significância de 5% para a tomada da decisão quanto à validade da hipótese testada. (AU)