Ferramentas de biologia sintética para produção escalável de ácido 3-hidroxipropiônico biorrenovável

Resumo

A capacidade de reprogramar o metabolismo microbiano para a produção de bioquímicos renováveis é essencial para o alcance de um futuro sustentável. No entanto, a engenharia genética do metabolismo celular para bioprodução pode levar à uma sobrecarga metabólica significativa, desafiando a produção em escala industrial de muitos bioquímicos de interesse a um custo competitivo. Por exemplo, esforços para alcançar a produção comercial do bioquímico plataforma ácido 3-hidroxipropiônico (3HP) ainda não foram bem-sucedidas. Isso se deve principalmente devido a um desbalanço das vias de biossíntese de 3HP testadas até o momento que sobrecarregam o metabolismo celular e também devido à uma competição direta entre produção de 3HP e vias endógenas necessárias para o crescimento celular. Neste projeto de pesquisa, serão aplicadas ferramentas modernas de biologia sintética e tecnologias em high-throughput para superar esses desafios e identificar um design ideal para a via de biossíntese de 3HP na levedura Saccharomyces cerevisiae. Serão investigadas duas estratégias de design que podem reduzir a sobrecarga metabólica causada pela produção de 3HP. Primeiramente, os níveis de expressão de cada enzima da via de biossíntese serão balanceados através de testes sistemáticos de expressão combinatória utilizando promotores com forças de expressão variáveis. Em paralelo, a competição entre vias essenciais para crescimento celular e para a produção de 3HP será reduzida através do desenvolvimento de circuitos genéticos que permitirão que as células autonomamente separem o processo de produção em duas fases distintas, uma fase de crescimento, com alta geração de biomassa e mínima produtividade, e uma fase de produção, com formação mínima de biomassa e alta produtividade. A estabilidade das linhagens engenheiradas durante um processo simulado de escalonamento será avaliada experimentalmente e modelada matematicamente. O sequenciamento do genoma de mutantes pouco produtivos irá revelar rotas comuns que levam à perda de genes da via de biossíntese de 3HP e irá informar novas rodadas de engenharia com o objetivo de minimizar a emergência e enriquecimento de mutantes na população. Finalmente, bibliotecas de deleção serão construídas para condução de uma busca por genes que conferem tolerância à 3HP em linhagens selvagens naturalmente mais tolerantes à este ácido carboxílico, esta busca cobrirá todos os genes não essenciais do genoma de levedura. Estes genes serão transferidos para as linhagens produtoras, gerando linhagens finais mais tolerantes, capazes produzir altos níveis de 3HP. Essa estratégia integrada tem o potencial de minimizar a sobrecarga metabólica causada pela biossíntese de 3HP, o que irá melhorar a performance e estabilidade de linhagens engenheiradas, gerando uma linhagem final altamente produtiva e propícia para testes em alta escala. (AU)