Detecção e caracterização de cepas circulantes de ISKNV (Vírus da necrose infecciosa de baço e rim), através de métodos fenotípicos e moleculares

Resumo

Nos últimos anos a ocorrência de doenças emergentes, principalmente as virais, são um tema de vanguarda e preocupação, tanto para a academia quanto para o setor produtivo. Entre as doenças emergentes de importância econômica na aquicultura temos a chamada infectious spleen and kidney necrosis virus disease (ISKNV). Esta doença viral não é uma zoonose e não é uma doença de notificação obrigatória, mas traz sérios prejuízos econômicos as pisciculturas. A infecção é caracterizada pela necrose esplênica e pela presença de células hipertróficas chamadas de megalocitos, que podem ser encontrados principalmente em mucosa intestinal, parênquima renal e hepático, e endotélio ventricular. Seus principais sinais clínicos são: anorexia, letargia, rápido movimento opercular; mudança na coloração corporal, exoftalmia e distensão abdominal. O diagnóstico pode ser feito observando os sinais clínicos, e para confirmação realiza-se exame histopatológico ou PCR. Entretanto, para se saber sobre a virulência das cepas e sua filogenia, os vírus precisam ser isolados em cultivos celulares. O cultivo ou cultura celular in vitro é um método alternativo que atende aos princípios éticos na substituição do uso de animais em laboratório. Somente com a utilização desta técnica é que poderemos avançar na diagnose e produção de vacinas para controle de doenças, principalmente as virais. Assim, este projeto objetiva detectar, através de diagnóstico molecular, cepas circulantes de ISKNV no Estado de São Paulo e, caracterizá-las, verificando sua virulência, através de isolamento em cultivo celular e sequenciamento genômico total do vírus. Adicionalmente, realizaremos a infecção experimental em alevinos, a fim de acompanhar a cinética de evolução desta doença. Serão amostrados aleatoriamente alevinos da população de duas pisciculturas que trabalham com larvicultura, em quatro distintas bacias hidrográficas no Estado de São Paulo (n=1248). Será dada preferência por animais sintomáticos, sejam nativos ou exóticos. As amostras serão processadas através de PCR convencional e q PCR. As amostras que forem ISKNV positivas seguirão para sequenciamento através do método Sanger para confirmação e tentativa de isolamento em cultivo celular em duas linhagens distintas: Células BF-2 (Bluegill Fry ) e Células GRF-1 (Grunt Fin cell). As amostras com efetivo efeito citopatogênico serão encaminhadas ao Wildlife and Aquatic Veterinary Disease Laboratory (WAVDL), na Universidade da Flórida, para sequenciamento total do genoma e análise filogenética. Após isolamento do ISKNV realizaremos a infecção experimental que será monitorada por análises de Hibridização in situ. Os resultados obtidos auxiliarão no avanço do conhecimento da virulência do ISKNV, com aplicações práticas para o desenvolvimento de produção de anticorpos monoclonais, testes rápidos, vacinas e outros mecanismos para prevenção e mitigação de danos causados por estes patógenos. (AU)