Análise funcional dos genes xanB e xylA potencialmente envolvidos com a patogenicidade de Xanthomonas citri subsp. citri

Resumo

O cancro cítrico é uma doença causada pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (XAC) que afeta todos os citros de importância comercial, enquanto que Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii (XauB) causa cancrose, forma mais amena da doença. Em projeto Jovem Pesquisador FAPESP do nosso grupo (2009-2017) as enzimas fosfomanose isomerase (PMI, codificada pelo gene xanB) e xilose isomerase (XI, codificada pelo gene xylA) foram identificadas por análise proteômica como potencialmente envolvidas na patogenicidade, sendo que XAC apresenta dois genes de xylA em contextos genômicos distintos, enquanto Xau-B apresenta um gene. A PMI e XI catalisam interconversão entre manose-6-fosfato/frutose-6-fosfato e xilose/xilulose, respectivamente. Este trabalho objetiva caracterizar funcionalmente os dois genes de xylA e o gene xanB, especialmente quanto à sua relação com a patogenicidade de XAC. Mutantes de XAC deletados para cada um deles, inclusive um duplo mutante de xylA, serão obtidos por dupla recombinação homóloga entre o DNA genômico e regiões flanqueadoras do gene clonadas no vetor suicida pNPTS138 e os mutantes serão testados quanto à patogenicidade in planta em relação à XAC. Para o gene cujo mutante de deleção for incapaz de causar a doença será realizada modelagem por homologia da proteína por ele codificada, para fins de proceder screening virtual e seleção de novos potenciais inibidores de bases de dados de compostos comercialmente disponíveis. A capacidade inibitória do composto selecionado será avaliada tanto in vitro, sobre a atividade da proteína-alvo (a ser produzida na forma recombinante), como in vivo, durante a infecção. XAC será caracterizada comparativamente com Xau-B e com os mutantes de deleção em relação à expressão dos genes xylA por qRT-PCR e Western Blot e/ou ELISA. As proteínas recombinantes PMI e XI serão produzidas em E. coli, purificadas e ensaiadas para suas atividades enzimáticas preditas. Confirmada a atividade, a estrutura tridimensional de ambas e ensaios de interação in vitro com o proteoma de XAC por Pull-Down serão realizados. Os efeitos da deleção de xanB e xylA no metabolismo serão avaliados por análise proteômica diferencial dos mutantes de deleção e XAC, com técnicas 2D e/ou free-gel, bem como por proteômica direcionada (SRM/ SWATH-MS). Até o momento várias etapas já foram realizadas, tais como: os 4 mutantes de deleção de XAC foram obtidos (3 para xylA e 1 para xanB) e um deles não produziu doença na planta; a proteína-alvo foi utilizada em modelagem e um dos compostos selecionados por screening virtual foi adquirido comercialmente para realizar os testes de inibição; a proteína XylA foi obtida na forma recombinante pura e apresentou atividade enzimática predita. O presente projeto já apresenta resultados parciais promissores do ponto de vista biotecnológico, podendo levar à proposição de novo(s) insumo(s) agrícolas para o controle do cancro cítrico e também a uma maior compreensão do papel biológico dos genes xanB e xylA na patogenicidade de XAC. (AU)