Caracterização funcional das E3 ubiquitina-ligases do tipo CRL (Cullin RING-ligases) em Leishmania infantum

Resumo

O sistema ubiquitina proteassoma (SUP) é o principal responsável pela proteólise intracelular em eucariotos e o processo de ubiquitinação se dá pela ação de três enzimas: E1 (enzima ativadora de ubiquitina), E2 (enzima carreadora de ubiquitina) e as E3 (ubiquitina-ligases) que exercem papel-chave neste processo, reconhecendo e transferindo ubiquitina para o substrato proteico. Estes podem ser direcionados ao proteassoma para degradação ou terem suas funções reguladas por esta modificação. Em protozoários parasitas, a proteólise intracelular é essencial para a alternância de hospedeiros em seus ciclos de vida e consequentemente para o sucesso do parasitismo. Pouco se sabe sobre o SUP em muitos parasitos, incluindo os tripanossomatídeos do gênero Leishmania, responsáveis por causarem as leishmanioses. No Brasil, a espécie Leishmania infantum é o agente etiológico da leishmaniose visceral (LV), a forma mais grave da doença, podendo ser fatal se não tratada. O proteassoma de Leishmania possui subunidades com alto grau de identidade ao de humanos, e vem sendo alvo de drogas para tratamento de leishmanioses. Recentemente, foram caracterizadas as enzimas E2 e deubiquitinases de L. mexicana, demonstrando o papel essencial na proliferação e infectividade dessa espécie. Por outro lado, as E3 ubiquitina-ligases de Leishmania permanecem não estudadas. Neste projeto, propomos caracterizar bioquimicamente os genes de L. infantum LINF_110018100), LINF_210005300 e LINF_240029100 que são ortólogos aos genes humanos SKP1, RBX1 e CUL1 respectivamente. Estes são componentes da mais bem estudada classe de E3 ligases em humanos, denominada Cullin RING Ligases (CRLs) ou SCF (SKP, Cullin, F-box). Para isso, parasitos da espécie L. infantum serão geneticamente modificados por meio da estratégia CRISPR-Cas9 para geração de linhagens nocautes ou expressando estes genes em fusão com as tags 3xmyc-mCherry. Realizaremos a caracterização fenotípica das linhagens (crescimento, infectividade e susceptibilidade a drogas in vitro) e bioquímica, por meio de imunoprecipitação das proteínas em fusão com myc tag, seguido de análise por espectrometria de massas para identificação dos ligantes. Buscaremos no interactoma das proteínas SKP, Cullin e RBX de L. infantum os potenciais componentes das CRLs deste parasito. Por fim, ensaios de validação de interação proteína-proteína e ubiquitinação in vitro e in vivo serão realizados. Os resultados deste projeto contribuirão para o conhecimento da fisiologia deste parasito e a sua relação com o hospedeiro, podendo levar a identificação de novos alvos para intervenção farmacológica visando o tratamento das leishmanioses. (AU)