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Influência das células B-1 ou de suas vesículas extracelulares na atividade de células imunes efetoras na microsporidiose

Resumo

Os microsporídios são reconhecidos como patógenos oportunistas em indivíduos com imunodeficiências, especialmente de células T. Embora a atividade de linfócitos T CD8 seja primordial para eliminação desses patógenos, macrófagos e outras células da imunidade inata apresentam um papel crítico na ativação da imunidade adquirida. As células B-1 constituem componente chave para a resposta imune inata contra patógenos, porém com participação ainda pouco compreendida. Anteriormente, nós demonstramos que camundongos deficientes em células B-1 (Xid) foram menos resistentes à encefalitozoonose experimental, apresentando alta carga fúngica, apesar do aumento da população de linfócitos T CD8. Em experimento in vitro, nós identificamos que na ausência de células B-1, os macrófagos peritoneais infectados com E. cuniculi apresentaram um perfil M2. Na presença de células B-1 ou de fagócitos derivados de B-1, os macrófagos tinham perfil predominantemente M1 e as células B-1 mostravam extremo contato físico com outras células imunitárias, como linfócitos e macrófagos, e a extensa liberação de vesículas extracelulares. Diante do exposto, o objetivo do presente projeto será avaliar os efeitos das células B-1 ou de suas vesículas extracelulares sobre a atividade citotóxica de linfócitos T CD8 e atividade fagocítica e microbicida de macrófagos na microsporidiose. Para tal serão realizados 3 experimentos: a) avaliação da atividade de linfócitos T CD8 provenientes de camundongos com e sem células B-1 sobre macrófagos infectados com E. cuniculi, b) caracterização do tamanho, do conteúdo e da função de vesículas extracelulares de células B-1 infectadas por E. cuniculi e seus efeitos sobre macrófagos de medula óssea, c) análise do efeito in vivo de vesículas extracelulares de células B-1 infectadas com E. cuniculi sobre linfócitos T CD8 e macrófagos de camundongos. Camundongos BALB/c, BALB/c Xid e Xid+B-1 (transferido adotivamente com células B-1) serão infectados ou não com esporos de E. cuniculi e, após 7 e 14 dias, os linfócitos T CD8 do baço serão purificados e co-cultivados com macrófagos previamente infectados com E. cuniculi. Após 36 e 72h serão avaliadas a proliferação, a viabilidade e a presença de moléculas de ativação (CD62L, CD69, CD107a, CD178, anti-perforina) nos linfócitos T CD8 e a produção de citocinas. Os macrófagos infectados com E. cuniculi serão analisados quanto a sua viabilidade e atividade microbicida. As mesmas moléculas de ativação serão mensuradas ex vivo em linfócitos T CD8 do peritônio, de linfonodos mesentéricos e do baço de camundongos com e sem células B-1 infectados com E. cuniculi. Células B-1 coletadas de camundongos BALB/c e purificadas serão infectadas ou não com E. cuniculi. Após incubação, as EVs serão analisadas quanto ao seu tamanho, quantidade, fenótipo e concentração proteica. Posteriormente, as EVs serão utilizadas para o tratamento in vitro de macrófagos de medula óssea de camundongos ou in vivo de camundongos BALB/c e Xid. Os macrófagos e os camundongos tratados com Evs serão desafiados com E. cuniculi. As funções fagocítica e microbicida, a produção de citocinas e a morte dos macrófagos serão avaliadas. A carga fúngica no fígado e presença de lesões histológicas nos animais será empregada para análise da infecção in vivo. Também serão mensuradas ex vivo as moléculas de ativação (CD62L, CD69, CD107a, CD178, anti-perforina) nos linfócitos T CD8 do peritônio, dos linfonodos mesentéricos e do baço dos camundongos tratados com Evs. A análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias será empregada para comparação entre os grupos. Os valores serão apresentados como médias experimentais±o erro padrão. Os valores de p<0,05 indicarão significância estatística, com intervalo de confiança de 95%. (AU)

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