Investigação do papel dos pirofosfatos de inositol (PP-IPs) em vias de reparo de DNA e dinâmica dos telômeros utilizando tripanossomatídeos como modelo

Resumo

Pirofosfatos de inositol (PP-IPs) são um grupo especializado de moléculas solúveis que apresentam um ou dois grupos pirofosfatos ligados ao anel inositol. Em eucariotos modelos, as moléculas de PP-IPs melhor caracterizadas são as PP-IP4, IP7 e IP8. Em mamíferos, essas moléculas estão envolvidas em vários processos celulares, entre os quais vias relacionadas ao metabolismo de DNA, como recombinação homóloga (HR) e controle do comprimento telomérico. Contudo, o mecanismo de ação dos PP-IPs nestas vias ainda não está estabelecido. PP-IP4, IP7 e IP8 são sintetizadas através de vias complementares que envolvem a participação das quinases IP6K e PP-IP5K. Parasitos tripanossomatídeos (e.g., T. cruzi e Leishmania spp.) têm genes ortólogos para IP6K, mas não possuem ortólogos para PP-IP5K, o que os impede de sintetizarem IP8, tornando-os excelentes modelos para o estudo de IP7 e PP-IP4. Além disso, tripanossomatídeos não realizam reparo de DNA por junção de pontas não-homólogas (NHEJ) e apresentam uma dinâmica telomérica divergente e ainda pouco compreendida. Deste modo, este projeto tem por objetivo investigar os mecanismos de ação dos PP-IPs em vias de reparo de DNA e manutenção telomérica utilizando tripanossomatídeos como modelo. Com isso, questões importantes serão abordadas, como por exemplo: Quais vias do metabolismo de DNA e quão crítico é a participação de IP7 e PP-IP4 nestas vias? Quais são os principais alvos de IP7 e PP-IP4 envolvidos nestas vias? A possível participação de IP7 ou PP-IP4 na dinâmica telomérica poderia ser uma consequência da participação destes PP-IPs na HR durante processos alternativos de elongamento telomérico (ALT)? Para abordar o objetivo principal e responder a estas questões, linhagens de L. braziliensis e T. cruzi que não sintetizem IP7 serão geradas por meio da depleção (KO) de IP6K utilizando CRISPR-Cas9. Em seguida, estas linhagens serão desafiadas com agentes genotóxicos específicos e a capacidade das principais vias de reparo de DNA (HR, BER e NER) e dinâmica telomérica serão analisadas. Concomitantemente, utilizando a mesma abordagem, serão geradas linhagens telomerase-KO e linhagens duplo-KO (IP6K-KO e telomerase-KO) para investigar se a possível regulação telomérica promovida por IP7 seria via ALT ou telomerase, uma vez que o mecanismo para realização do ALT se assemelha à HR. Para isso, a dinâmica de elongamento dos telômeros (após encurtamento propiciado por peróxido de hidrogênio) será analisada por meio dos ensaios Southern blot, flow-fish e STEX. Por fim, utilizando uma abordagem audaciosa, moléculas de IP7 e PP-IP4 serão sintetizadas in vitro com a porção beta-fosfato marcada. Estas moléculas serão utilizadas em reações de pirofosforilação, onde espera-se que haja hidrólise da porção pirofosfato, e transferência não-enzimática do grupo beta-fosfato para proteínas-alvo. O rastreio das proteínas-alvo será realizado por espectrometria de massas (LC-MS/MS) após ensaios de captura do tipo pull-down. Ensaios para investigar a função química/estrutural dos pirofosfatos nas proteínas-alvo também serão realizados (e.g., molecular docking, SAXS e cryo-EM). Assim, além de ampliar nossa compreensão sobre o papel dos PP-IPs em vias cruciais do metabolismo do DNA, comparativamente este projeto fornecerá uma visão de como a essencialidade dessas moléculas se diversificou ao longo da evolução. Pirofosforilações por PP-IPs não são enzimáticas e representam uma nova e pouco conhecida forma de modificação pós-traducional. Vale ressaltar também que, como IP7 é sintetizado especificamente por IP6K e quinases são excelentes alvos para o desenvolvimento de drogas, este projeto pode fornecer uma nova rota para a criação de quimioterapias efetivas, não apenas contra parasitos tripanossomatídeos (agentes etiológicos de diversas doenças negligenciadas), mas também contra quaisquer células cujo reparo de DNA e elongamento telomérico a curto prazo sejam essenciais à proliferação, como por exemplo células malignas. (AU)