Estudos sobre a biogênese e composição do complexo ribonucleoprotéico da telomerase de Leishmania spp. e sua regulação

Resumo

As leishmanioses são doenças tropicais transmitidas por parasitos primitivos da família Trypanosomatidae, gênero Leishmania. Estas doenças se apresentam com diferentes formas clínicas que vão desde úlceras superficiais até doença disseminada não havendo programas adequados de controle ou combate as mesmas. Os tratamentos existentes apresentam alta toxicidade, baixa eficácia, alto custo e levam ao aparecimento de parasitos e vetores resistentes. O entendimento mais aprofundado sobre as maquinarias moleculares do parasito poderão ser de grande auxílio no reconhecimento de novos alvos terapêuticos contra Leishmania. Uma das maquinarias a serem consideradas, é a maquinaria telomérica pois ela exerce papel fundamental na manutenção da estabilidade do genoma e na proliferação celular. Os telômeros são estruturas nucleoproteicas mantidas pela ação do complexo ribonucleoproteico (RNP) telomerase composto minimamente por uma proteína, TERT (Telomerase Reverse Transcriptase), e um RNA longo não codificador, (TER, Telomerase RNA), que contém o molde para adição das repetições teloméricas. A biogênese e montagem do complexo telomerase RNP é bem conhecida em organismos modelos e ocorre via interações estruturais entre alguns dos domínios do componente TERT, elementos da estrutura secundária do componente TER e proteínas acessórias. Já a interação entre os componentes do complexo RNP e componentes da cromatina telomérica, é dinâmica e finamente regulada, e é vital para a manutenção dos telômeros. Tanto a atividade enzimática quanto os genes que codificam para os dois componentes da telomerase de Leishmania spp. já foram identificados e caracterizados pelo nosso grupo. Entretanto, ainda não se conhece sua biogênese, como ocorrem as interações entre eles e se existe algum nível de regulação nessas interações. Neste contexto, é importante ressaltar que nosso grupo já descreveu vários componentes da cromatina telomérica do parasito onde destacamos as proteínas ligantes de DNA telomérico na forma de dupla fita e da simples fita rica em G, assim como do lncRNA TERRA, que em outros eucariotos exerce funções não somente na manutenção da cromatina como também regula a atividade da telomerase e a longevidade celular. Neste trabalho pretendemos: i) caracterizar estruturalmente os domínios da TERT usando ensaios bioquímicos e biofísicos, para verificar as interações entre os domínios da TERT e o DNA telomérico, ii) tentar obter a estrutura cristalográfica de domínios da TERT, iii) estudar como se dá a interação entre os domínios da TERT e o componente TER, iiiv) verificar a função dos componentes TERT e TER na manutenção dos telômeros e na sobrevida de L. major e L. infantum compararndo os fenótipos entre parasitos nocaute (obtidos por CRISPR), superexpressores e tratados com o fármaco BIBR1532 (inibidor da telomerase), iv) comparar a constituição do complexo ribonucleoprotéico telomerase em linhagens de L. major e L. infantum com diferentes background genéticos (por ex. nocaute e superexpressor) usando análise proteômica e espectrometria de massa e vi) Verificar como e em que circunstancias os lncRNA TERRA podem regular a atividade de telomerase e/ou a manutenção dos telômeros por análise transcriptomica e nocaute. Vale lembrar que os componentes do complexo telomerase das Leishmanias, assim como as proteínas que compõem a cromatina telomérica do parasito e a expressão dos transcritos TERRA, embora compartilhem algum nível de conservação com as de outros eucariotos, apresentam características estruturais, bioquímicas ou de regulação, específicas do gênero. Por isso, o estudo da biogênese do complexo telomerase e suas interações com os telômeros, com a cromatina telomérica e com transcritos TERRA, podem auxiliar no entendimento sobre a evolução desta maquinaria nos eucariotos e a perturbar a homeostase do parasita com intuito de se encontrar novos alvos parasito-específicos contra a leishmaniose. (AU)