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(Referência obtida automaticamente do Web of Science, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores.)

Endogenous C-terminal Tagging by CRISPR/Cas9 in Trypanosoma cruzi

Texto completo
Autor(es):
Lander, Noelia [1] ; Chiurillo, Miguel A. [1] ; Vercesi, Anibal E. [1] ; Docampo, Roberto [2, 3, 1]
Número total de Autores: 4
Afiliação do(s) autor(es):
[1] Univ Estadual Campinas, Fac Ciencias Med, Dept Patol Clin, BR-13083 Campinas, SP - Brazil
[2] Univ Georgia, Ctr Trop & Emerging Global Dis, Athens, GA 30602 - USA
[3] Univ Georgia, Dept Cellular Biol, Athens, GA 30602 - USA
Número total de Afiliações: 3
Tipo de documento: Artigo Científico
Fonte: BIO-PROTOCOL; v. 7, n. 10 MAY 20 2017.
Citações Web of Science: 7
Resumo

To achieve the C-terminal tagging of endogenous proteins in T. cruzi we use the Cas9/pTREX-n vector (Lander et al., 2015) to insert a specific tag sequence (3xHA or 3xc-Myc) at the 3' end of a specific gene of interest (GOI). Chimeric sgRNA targeting the 3' end of the GOI is PCR-amplified and cloned into Cas9/pTREX-n vector. Then a DNA donor molecule to induce DNA repair by homologous recombination is amplified. This donor sequence contains the tag sequence and a marker for antibiotic resistance, plus 100 bp homology arms corresponding to regions located right upstream of the stop codon and downstream of the Cas9 target site at the GOI locus. Vectors pMOTag23M (Oberholzer et al., 2006) or pMOHX1Tag4H (Lander et al., 2016b) are used as PCR templates for DNA donor amplification. Epimastigotes co-transfected with the sgRNA/Cas9/pTREX-n construct and the DNA donor cassette are then cultured for 5 weeks with antibiotics for selection of double resistant parasites. Endogenous gene tagging is finally verified by PCR and Western blot analysis. (AU)

Processo FAPESP: 13/50624-0 - Sinalização por íons de cálcio em tripanossomatídeos
Beneficiário:Roberto Docampo
Linha de fomento: Auxílio à Pesquisa - Programa SPEC
Processo FAPESP: 14/13148-9 - Sinalização por íons de cálcio em tripanossomatídeos
Beneficiário:Miguel Angel Chiurillo Siervo
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Processo FAPESP: 14/08995-4 - Sinalização por íons de cálcio em tripanosomatídeos
Beneficiário:Noelia Marina Lander Manfredi
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado